冷凍電子顯微鏡技術(shù)在細胞混合物純化中應(yīng)用
純化需要從復(fù)雜的混合物中分離出一種蛋白質(zhì)，混合物通常又來源
于細胞裂解物。純化方案的目的是分離得到無雜蛋白的單一蛋白質(zhì)并保
留它全部或大部分的生物活性。
由于克隆與重組DNA技術(shù)的發(fā)展使蛋白質(zhì)可以在外源宿主細胞中大
量表達從而給純化方法提供了很大的幫助。這使在以往不可能被研究的
很難分離的蛋白質(zhì)被研究。
純化方法是依賴于蛋白質(zhì)的生物物理性質(zhì)的，例如，分子質(zhì)量、電
荷、疏水性和流體動力學半徑通常被作為分離技術(shù)的基礎(chǔ)。層析方法形
成了蛋白質(zhì)純化中較常用的制備技術(shù)。
在所有的例子中，層析包括流動相(通常是水相)與含有促進與一些
蛋白質(zhì)相互作用的功能基團的惰性支持物(樹脂)相互作用。在離子交換
色譜中，支持基質(zhì)包括帶負電或正電的基團。根據(jù)流體動力學半徑(分
子排阻層析)、配體結(jié)合(親和層析)和非極性相互作用(HIC和RPC)可以
用相似的辦法分離蛋白質(zhì)。
與制備技術(shù)一起用的是分析方法，用來確定產(chǎn)物的純度與分子質(zhì)量
。SDSPAGE在電場作用下僅根據(jù)分子質(zhì)量來分離蛋白質(zhì)。這種技術(shù)在確
定亞基分子質(zhì)量及總蛋白純度方面被證明有廣泛的價值。
在SDS-PAGE技術(shù)上擴展的一種方法是蛋白質(zhì)印跡。這種方法可以通
過與特異抗體的相互作用來確定混合物中的抗原蛋白質(zhì)(該混合物已經(jīng)
是根據(jù)大小分離的組分)。
雙向電泳可以根據(jù)分子質(zhì)量與總電荷來分離蛋白質(zhì)。因此，對一種
細胞或機體使用這種方法，可以確定單細胞種類的機體或一種細胞中大
量不同的蛋白質(zhì)。
在所有分析方法中，質(zhì)譜分析技術(shù)很重要，因為這種技術(shù)可以精確
的檢測分子離子的核質(zhì)比。其中較常用的方法是MALDI—TOF及電噴霧質(zhì)
譜。用現(xiàn)代的儀器蛋白質(zhì)的分子質(zhì)量可以檢測到la．m．U．水平。
結(jié)合一向和兩向凝膠方法，質(zhì)譜分析被證明在蛋白質(zhì)組學研究中很
有價值。在過去的基因組革命基礎(chǔ)上發(fā)展起來的蛋白質(zhì)組學對制備和分
析技術(shù)有更高的要求。這里講述的幾種方法結(jié)合核磁共振、X射線晶體
分析法或冷凍電子顯微鏡技術(shù)一起使用，可以在相對短的時間內(nèi)完成從
基因測定到蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)分析。
