利用電子顯微鏡和熒光顯微鏡觀察細胞中蛋白質(zhì)
采用生物化學、遺傳學、細胞生物學、分子生物學和電子顯微技術
對蛋白質(zhì)定向、轉位和轉運的機制已進行了廣泛研究。本章將涉及
用于蛋白質(zhì)輸出的研究技術。我們將這些技術分為四類：細胞內(nèi)、
遺傳學、細胞外和細胞生物學技術。當檢驗一種蛋白質(zhì)在完整細胞
內(nèi)的運動時，細胞內(nèi)技術是必需的，并且常常使用遺傳學方法來識
別突變體。遺傳學技術是細胞內(nèi)技術的分支，它在蛋白質(zhì)轉運研究
領域中起著較重要的作用。遺傳學技術已揭示了許多在蛋白質(zhì)輸出
過程中轉運復合體的蛋白質(zhì)組分。細胞外技術也起到重要作用，它
用于確定被純化蛋白質(zhì)的功能，目的在于通過實驗重現(xiàn)蛋白質(zhì)轉運
的過程。應用細胞生物學技術，已可利用電子顯微鏡和熒光顯微鏡
觀察一個蛋白質(zhì)在細胞中的運動。
真核細胞細胞器和細胞膜的分離
采用生物化學方法確定蛋白質(zhì)在亞細胞器上的準確定位需要破
壞細胞形態(tài)，且需要將膜分離出來，因為真核細胞含有許多不同的
膜。這些膜包括質(zhì)膜、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜、核膜、高爾基復合體膜、過氧化
物酶體膜、溶酶體膜、線粒體膜，以及植物細胞中葉綠體膜和葉綠
體中的類囊體膜。已有證據(jù)表明膜定位是蛋白質(zhì)共定位到其目標膜
上的過程。為了分離細胞器，首先要用盡可能溫和的方法使細胞破
碎。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜，又稱微體，通常用Potter-Elvehjem勻漿機將狗的
胰腺勻漿，然后在低速離心下沉淀微體，再通過凝膠過濾柱進行過
濾。用各細胞器的標志酶來鑒定其分離純度。
細胞內(nèi)研究·用藥物和Sec突變體可揭示膜轉位是否需要質(zhì)子動
力勢能以及Sec蛋白的作用�！さ鞍酌概c膜的接觸以及信號肽加工
方面的研究為跨越細菌和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜的蛋白質(zhì)定位提供確定方法。·
天冬氨酸連接的寡糖修飾可用于跟蹤在分泌途徑中的糖蛋白定位。
·通過確定輸出蛋白質(zhì)是否與相應亞細胞組分一同被分離，可監(jiān)測
該蛋白質(zhì)是否
定向到細胞器、細胞內(nèi)膜結構或液態(tài)組分。
