視頻光學(xué)倒置熒光顯微鏡-細(xì)胞器的超微結(jié)構(gòu)檢測(cè)
相關(guān)的視頻光學(xué)／電子顯微鏡術(shù)基本方案
相關(guān)的視頻光學(xué)／電子顯微鏡術(shù)
這種方法采用免疫金染色法和免疫過(guò)氧化物酶染色法來(lái)做電鏡
標(biāo)本的染色
通常免疫金染色法常用來(lái)標(biāo)記絕大部分抗原；而免疫過(guò)氧化物
酶染色法通常僅用來(lái)標(biāo)記那些位于膜包被的小間隔內(nèi)的抗原，這是
因?yàn)檫^(guò)氧化物酶反應(yīng)生成的電子致密產(chǎn)物易從抗體結(jié)合處彌散開。
只有采用免疫金染色法才能標(biāo)記位于胞質(zhì)內(nèi)的GFP融合蛋白質(zhì)的抗
原決定簇。此外，HRP(辣根過(guò)氧化物酶)標(biāo)記也適用于其他的抗原
決定簇。
值得一提的是，許多用免疫熒光顯示結(jié)果非常好的抗體在免疫
源性電鏡染色中不甚理想，因?yàn)樵诙鄶?shù)電鏡標(biāo)本的固定過(guò)程中用到
的戊二醛很容易與抗原決定簇中的氨基酸基團(tuán)橋聯(lián)到一起；然而，
若是減少或者不用戊二醛會(huì)造成細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞器的超微結(jié)構(gòu)無(wú)法很好
保存。如果免疫源性電鏡標(biāo)記行不通，可以采用一些調(diào)節(jié)手段
將培養(yǎng)皿放于倒置熒光顯微鏡下，選擇一個(gè)轉(zhuǎn)染的目的細(xì)胞，確定
其在細(xì)胞定位柵
格坐標(biāo)上的相對(duì)位置，并在細(xì)胞定位柵格圖上繪出(照出)其位置
。
用多光子顯微鏡、激光掃描共焦顯微鏡或者數(shù)碼熒光倒置顯微
鏡(通過(guò)計(jì)算機(jī)能獲得一系列時(shí)延性圖像)來(lái)觀察選擇的活細(xì)胞內(nèi)
GFP標(biāo)記結(jié)構(gòu)的動(dòng)態(tài)變化。
在攝取圖像的過(guò)程中，如果有感興趣的圖像，則向細(xì)胞培養(yǎng)基
中加入固定劑A(細(xì)胞培養(yǎng)基／固定劑A一1：1)。
停止攝取影像，細(xì)胞在固定劑A內(nèi)放置5～10min。如果需要，繼
續(xù)攝取一系列細(xì)胞影像。
